10.10.  ®Þnh l­îng vitamin A

 

Ho¹t lùc cña vitamin A ®­îc tÝnh theo ®¬n vÞ quèc tÕ (ký hiÖu IU). 1 IU vitamin A t­¬ng ®­¬ng víi 0,300 mg retinol; 0,344 mg retinyl acetat; 0,359 mg retinyl propionat hoÆc 0,550 mg retinyl palmitat.

Vitamin A rÊt dÔ bÞ oxy ho¸ nªn ®iÒu kiÖn tiÕn hµnh chung lµ ph¶i nhanh chãng, tr¸nh ¸nh s¸ng vµ sö dông kÌm theo chÊt chèng oxy ho¸.

Tïy theo ®Æc ®iÓm cña vitamin A trong c¸c thuèc vµ nguyªn liÖu lµm thuèc mµ ¸p dông 1 trong 5 ph­¬ng ph¸p d­íi ®©y ®Ó ®Þnh l­îng.

Ph­¬ng ph¸p 1

(Ph­¬ng ph¸p ®o quang trùc tiÕp):

Cã thÓ ¸p dông ®èi víi c¸c nguyªn liÖu vitamin A ester tæng hîp (retinyl acetat, retinyl propionat hoÆc retinyl palmitat … ) vµ c¸c dÇu hoÆc nang mÒm chøa vitamin A ester víi hµm l­îng lín (³5000 IU/g).

C©n chÝnh x¸c kho¶ng tõ 25 mg ®Õn 100 mg chÕ phÈm vµ ®em hoµ tan trong 5 ml pentan (TT) råi pha lo·ng trong isopropanol (TT1) ®Ó ®­îc dung dÞch chøa chÝnh x¸c kho¶ng 10 ®Õn 15 IU vitamin A trong 1 ml. X¸c ®Þnh b­íc sãng cã hÊp thô cùc ®¹i vµ ®é hÊp thô cña dung dÞch t¹i c¸c b­íc sãng 300 nm, 326 nm, 350 nm vµ 370 nm trong cèc ®o dµy 1 cm, dïng isopropanol (TT1) lµm mÉu tr¾ng. TÝnh tû lÖ ®é hÊp thô t¹i c¸c b­íc sãng 300 nm, 350 nm vµ 370 nm so víi ®é hÊp thô t¹i b­íc sãng 326 nm (Al/A326).

NÕu cùc ®¹i hÊp thô n»m trong d¶i sãng tõ 325 nm ®Õn 327 nm vµ tû lÖ Al/A326 kh«ng lín h¬n c¸c gi¸ trÞ ghi d­íi ®©y:

0,593   ë   l = 300 nm.

0,537   ë   l = 350 nm.

0,142   ë   l = 370 nm.

th× tÝnh kÕt qu¶ hµm l­îng vitamin A trong mÉu thö (IU/g) theo c«ng thøc:

               

Trong ®ã:

A326 lµ ®é hÊp thô quang t¹i b­íc sãng 326nm.

m lµ l­îng chÕ phÈm ®em thö (g).

V lµ l­îng thÓ tÝch dung dÞch thu ®­îc sau khi pha lo·ng ®Ó ®em ®o (ml).

NÕu cùc ®¹i hÊp thô n»m ngoµi d¶i sãng tõ 325 nm ®Õn 327 nm hoÆc cã mét gi¸ trÞ Al/A326 lín h¬n gi¸ trÞ quy ®Þnh th× kÕt qu¶ kh«ng cã gi¸ trÞ, tiÕn hµnh ®Þnh l­îng chÕ phÈm nµy theo ph­¬ng ph¸p 2 hoÆc 3 hoÆc 4.

Ph­¬ng ph¸p 2

(Ph­¬ng ph¸p ®o quang sau khi chiÕt t¸ch vitamin A):

Cã thÓ ¸p dông cho  c¸c nguyªn liÖu vitamin A cã nguån gèc tù nhiªn vµ ®a sè c¸c d¹ng thuèc chøa vitamin A: Viªn nang, viªn nÐn, thuèc bét, thuèc mì, dÇu gan c¸...

LÊy chÝnh x¸c 1 l­îng chÕ phÈm kh«ng Ýt h¬n 500 IU vitamin A vµ kh«ng nhiÒu h¬n 1 gam chÊt bÐo cho vµo b×nh nót mµi, thªm 30 ml ethanol (TT), 3 ml dung dÞch kali hydroxyd b·o hßa (TT), vµi viªn ®¸ mÇm s«i, ®un s«i 30 phót trªn c¸ch thuû cã l¾p èng sinh hµn håi l­u, d­íi dßng khÝ nitrogen kh«ng cã oxygen. Lµm nguéi nhanh råi dïng 30 ml n­íc cÊt chuyÓn hÕt hçn hîp sang b×nh g¹n, thªm 4 gam natri sulfat (TT) ®· nghiÒn mÞn. ChiÕt vitamin A víi 150 ml ether (TT) vµ l¾c 2 phót (nÕu t¹o thµnh nhò t­¬ng th× chiÕt thªm 3 lÇn n÷a, mçi lÇn víi 25 ml ether). TËp trung dÞch chiÕt l¹i råi röa dÞch chiÕt 4 lÇn, mçi lÇn 50 ml n­íc cÊt, chó ý l¾c rÊt nhÑ nhµng ë 2 lÇn ®Çu ®Ó tr¸nh t¹o thµnh nhò t­¬ng. Lµm bay h¬i dÞch chiÕt ether trªn c¸ch thuû d­íi dßng khÝ nitrogen kh«ng cã oxygen hoÆc cÊt quay ch©n kh«ng ë nhiÖt ®é kh«ng qu¸ 30 0C ®Õn hÕt dung m«i. Hoµ tan c¾n trong mét l­îng isopropanol (TT) võa ®ñ ®Ó thu ®­îc dung dÞch chøa 10 - 15 IU vitamin A trong 1 ml.

§o ®é hÊp thô cña dung dÞch nµy ë c¸c b­íc sãng 300 nm, 310 nm, 325 nm, vµ 334 nm trong cèc dµy 1cm víi mÉu tr¾ng lµ isopropanol (TT),  sau ®ã x¸c ®Þnh b­íc sãng cã hÊp thô cùc ®¹i.

NÕu cùc ®¹i hÊp thô n»m trong d¶i sãng tõ 323 nm ®Õn 327 nm vµ tû lÖ A300/A325 £ 0,73  th× kÕt qu¶ ®­îc tÝnh nh­ sau:

TÝnh ®é hÊp thô hiÖu chØnh A325(K):

A325(K) = 6,815A325 - 2,555A310 - 4,260A334

NÕuA325(K)/A325 ³ 0,970 th× tÝnh kÕt qu¶ hµm l­îng vitamin A trong mÉu thö (IU/g) theo c«ng thøc sau:

                (IU/g)

Trong ®ã:

A325 lµ ®é hÊp thô quang t¹i b­íc sãng 325nm.

m lµ l­îng chÕ phÈm ®em thö (g).

V lµ l­îng thÓ tÝch dung dÞch thu ®­îc sau khi hoµ tan ®Ó ®em ®o (ml).

NÕu A325(K)/A325 < 0,970 th× kÕt qu¶ vÉn tÝnh theo c«ng thøc trªn nh­ng thay A325 b»ng A325(K).

NÕu cùc ®¹i hÊp thô n»m ngoµi kho¶ng 323 - 327 nm

hoÆc tû lÖ A300/A325 > 0,73 th× ph¶i tiÕn hµnh theo ph­¬ng ph¸p 5.

Chó ý:

Trong c¸ch tiÕn hµnh ph­¬ng ph¸p 2 nÕu chÕ phÈm ë d¹ng viªn nang, viªn nÐn hoÆc chÊt r¾n kh¸c nhau sau khi ®· bá vá, nghiÒn thµnh bét mµ vÉn kh«ng xµ phßng ho¸ ®­îc (do ë d¹ng vi nang) th× ph¶i xö lý tr­íc b»ng c¸ch ®un nãng víi 10 ml n­íc cÊt trªn c¸ch thñy 5 phót, dïng ®òa thñy tinh nghiÒn nhá c¸c chÊt r¾n cßn l¹i vµ gi÷ nãng 5 phót n÷a.

Khi tiÕn hµnh xµ phßng hãa, nÕu kh«ng cã khÝ nitrogen cã thÓ thay thÕ b»ng c¸ch cho chÊt chèng oxy hãa vµo b×nh ph¶n øng nh­ 3 ml dung dÞch hydroquinon 1% trong ethanol, hoÆc 30 mg BHT (butyl hydroxytoluen).

§Ó chiÕt vitamin A cã thÓ thay ether b»ng ether dÇu háa hoÆc n- hexan.

Ph­¬ng ph¸p 3

(Ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng trùc tiÕp)

Cã thÓ ¸p dông ®èi víi c¸c nguyªn liÖu vitamin A tæng hîp, c¸c thµnh phÈm chøa vitamin A tæng hîp mµ trong thµnh phÇn chØ chøa vitamin A ë mét d¹ng ester ®ång nhÊt hoÆc d¹ng retinol.

TiÕn hµnh theo ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng (Phô lôc 5.3).

§iÒu kiÖn s¾c ký:

Pha ®éng: Methanol - ethyl acetat - n­íc (90 : 7 : 3).

Dung dÞch thö:

LÊy chÝnh x¸c mét l­îng chÕ phÈm cã chøa kho¶ng 4000 IU vitamin A cho vµo b×nh ®Þnh møc dung tÝch 100 ml, thªm ethanol (TT), l¾c kü råi thªm ethanol (TT) ®Õn ®Þnh møc, l¾c ®Òu, läc.

Dung dÞch chuÈn:

Pha chÊt chuÈn vitamin A (d¹ng gièng víi dung dÞch thö: Retinol, Retinyl acetat, Retinyl palmitat …) trong ethanol (TT) ®Ó thu ®­îc dung dÞch chuÈn cã nång ®é vitamin A chÝnh x¸c kho¶ng 40 IU/ml.

Cét thÐp kh«ng gØ (25 cm ´ 4 mm) ®­îc nhåi Octadecylsilyl Silica gel (5 mm hoÆc 10mm).

Detector quang phæ tö ngo¹i ®Æt ë b­íc sãng 325 nm.

Tèc ®é dßng: 1,5 - 2,0 ml/phót.

ThÓ tÝch tiªm: 20 ml.

C¸ch tiÕn hµnh:

KiÓm tra kh¶ n¨ng thÝch hîp cña hÖ thèng s¾c ký: TiÕn hµnh s¾c ký víi dung dÞch chuÈn, ®é lÖch chuÈn t­¬ng ®èi cña diÖn tÝch pic thu ®­îc trªn s¾c ký ®å cña 6 lÇn tiªm lÆp l¹i mÉu chuÈn (RSD) kh«ng ®­îc lín h¬n 2%.

TiÕn hµnh s¾c ký lÇn l­ît víi dung dÞch chuÈn vµ dung dÞch thö . C¸ch tÝnh kÕt qu¶:

Hµm l­îng vitamin A trong mÉu thö (IU/g) ®­îc tÝnh theo c«ng thøc:

                                                            ST ´ C ´100

                                                   

                                                               SC ´ mT

Trong ®ã:

ST vµ SC lµ diÖn tÝch cña pic vitamin A trªn s¾c ®å cña thö vµ chuÈn.

mT lµ l­îng c©n mÉu thö (g).

C lµ nång ®é dung dÞch chuÈn ®em ®o s¾c ký (IU/ml).

Chó ý:

Trong viÖc chuÈn bÞ dung dÞch thö, nÕu chÕ phÈm ë d¹ng viªn nang, viªn nÐn hoÆc chÊt r¾n kh¸c nhau, sau khi bá vá, nghiÒn thµnh bét, mµ vitamin A vÉn kh«ng hoµ tan ®­îc trong ethanol (do ë d¹ng vi nang) th× ph¶i xö lý tr­íc b»ng c¸ch ®un nãng víi 10 ml n­íc cÊt trªn c¸ch thuû 5 phót, dïng ®òa thuû tinh nghiÒn nhá c¸c khèi r¾n cßn l¹i vµ gi÷ nãng thªm 5 phót n÷a råi míi cho ethanol vµo ®Ó hoµ tan.

NÕu mÉu thö cã nhiÒu t¸ d­îc d¹ng dÇu th× nªn thªm 2 ml ethyl acetat(TT)  hoÆc 2 ml n-hexan (TT) vµ l¾c kü tr­íc khi cho ethanol vµo ®Ó hßa tan.

NÕu trªn s¾c ®å thu ®­îc ngoµi pic cña d¹ng vitamin A cÇn ®o cßn cã pic cña d¹ng vitamin A kh¸c th× ph¶i tiÕn hµnh theo ph­¬ng ph¸p 2 hoÆc 5.

 

Ph­¬ng ph¸p 4

(Ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng sau khi thuû ph©n)

Cã thÓ ¸p dông ®èi víi nguyªn liÖu vitamin A tæng hîp d¹ng bét, d¹ng dÇu vµ d¹ng nhò t­¬ng.

TiÕn hµnh theo ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng (Phô lôc5.3).

Pha ®éng: Hçn hîp Methanol - n­íc (95 : 5).

Dung dÞch thö:

Dung dÞch thö A:

§èi víi nguyªn liÖu d¹ng bét: LÊy chÝnh x¸c mét l­îng chÕ phÈm cã chøa kho¶ng 120000 IU vitamin A cho vµo b×nh ®Þnh møc dung tÝch 50 ml. Thªm kho¶ng 20 mg ®Õn 30 mg bromelains (TT), 20 mg ®Õn 30 mg BHT (TT), 2,0 ml n­íc  vµ 0,15 ml isopropanol (TT). Lµm nãng trong c¸ch thuû ë 60 oC – 65 oC trong thêi gian 2 ®Õn 5 phót. Lµm l¹nh tíi 30 0C råi thªm 20 ml dung dÞch tetrabutylamoni hydroxyd 0,1 M trong isopropanol. L¾c siªu ©m 5 phót. Thªm isopropanol (TT) ®Õn v¹ch, l¾c ®Òu (l¾c xoay trßn, tr¸nh t¹o bät khÝ).

§èi víi nguyªn liÖu d¹ng dÇu hoÆc nhò t­¬ng: LÊy chÝnh x¸c mét l­îng chÕ phÈm cã chøa kho¶ng 120000 IU vitamin A cho vµo b×nh ®Þnh møc dung tÝch 50 ml, hßa tan ngay trong 5 ml pentan (TT). Thªm kho¶ng 20 mg ®Õn 30 mg BHT (TT) vµ 20 ml dung dÞch tetrabutylamoni hydroxyd 0,1 M trong isopropanol. L¾c siªu ©m 5 phót. Thªm isopropanol (TT) ®Õn v¹ch, l¾c ®Òu (l¾c xoay trßn, tr¸nh t¹o bät khÝ).

Dung dÞch thö B:

Cho kho¶ng 20 mg ®Õn 30 mg BHT (TT) vµo b×nh ®Þnh møc dung tÝch 50 ml, thªm 5 ml isopropanol (TT), l¾c cho tan, thªm 5,0 ml dung dÞch thö A, thªm isopropanol (TT) tíi v¹ch, l¾c ®Òu, läc.

Dung dÞch chuÈn:

Dung dÞch chuÈn A:

C©n chÝnh x¸c mét l­îng chÊt chuÈn Retinyl acetat t­¬ng ®­¬ng víi 120000 IU vitamin A cho vµo b×nh ®Þnh møc dung tÝch 50 ml. Thªm ngay 5 ml pentan (TT), thªm kho¶ng 20 mg ®Õn 30 mg BHT (TT) vµ 20 ml dung dÞch tetrabutylamoni hydroxyd 0,1 M trong isopropanol. L¾c siªu ©m 5 phót. Thªm isopropanol (TT) ®Õn v¹ch, l¾c ®Òu (l¾c xoay trßn, tr¸nh t¹o bät).

Dung dÞch chuÈn B:

Cho kho¶ng 20 mg ®Õn 30 mg BHT (TT) vµo b×nh ®Þnh møc dung tÝch 50 ml, thªm 5 ml isopropanol, l¾c cho tan, thªm 5,0 ml dung dÞch chuÈn A råi thªm isopropanol (TT) ®Õn v¹ch, l¾c ®Òu.

§iÒu kiÖn s¾c ký:

Cét thÐp kh«ng gØ (25 cm ´ 4 mm) ®­îc nhåi Octadecylsilyl Silica gel (5 mm hoÆc 10mm).

Detector quang phæ tö ngo¹i ®Æt ë b­íc sãng 325 nm.

Tèc ®é dßng: 1 ml/phót.

ThÓ tÝch tiªm: 20 ml.

 

C¸ch tiÕn hµnh:

Gièng nh­ ph­¬ng ph¸p 3 víi  dung dÞch chuÈn B vµ dung dÞch thö B.

C¸ch tÝnh kÕt qu¶:

Hµm l­îng vitamin A trong mÉu thö (IU/g) ®­îc tÝnh theo c«ng thøc:

    ST ´ C ´mC

 


                                                                   SC ´ mT

Trong ®ã:

ST, SC     lµ diÖn tÝch pic cña vitamin A trªn s¾c ®å cña thö vµ chuÈn.

mC, mT lµ l­îng c©n mÉu chuÈn, thö (g).

C  lµ hµm l­îng chÊt chuÈn vitamin A (IU/g).

KÕt qu¶ ®­îc chÊp nhËn nÕu:

§é lÖch chuÈn t­¬ng ®èi cña diÖn tÝch pic thu ®­îc trªn s¾c ký ®å cña 6 lÇn tiªm lÆp l¹i mÉu chuÈn (RSD) kh«ng ®­îc lín h¬n 2%.

Trªn s¾c ®å cña dung dÞch chuÈn ngoµi pic cña Retinol kh«ng cã pic cña Retinyl acetat ch­a thñy ph©n.

Ph­¬ng ph¸p 5:

(Ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng sau khi chiÕt t¸ch vitamin A)

Cã thÓ ¸p dông ®èi víi c¸c chÕ phÈm phøc t¹p vµ cã chøa vitamin A víi hµm l­îng thÊp kh«ng thùc hiÖn ®­îc 1 trong 4 ph­¬ng ph¸p trªn.

TiÕn hµnh b»ng ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng (Phô lôc 5.3).

Pha ®éng: Hçn hîp Methanol - n­íc (97 : 3).

§iÒu kiÖn s¾c ký:

Cét thÐp kh«ng gØ (25 cm ´ 4 mm) ®­îc nhåi Octadecylsilyl Silica gel (5 mm hoÆc 10 mm).

Tèc ®é dßng: 1 ml/phót.

Detector quang phæ tö ngo¹i ®Æt ë b­íc sãng 325 nm.

ThÓ tÝch tiªm: 10 ml.

Dung dÞch thö:

LÊy chÝnh x¸c mét l­îng chÕ phÈm cã chøa kho¶ng 2000 IU vitamin A ®em xµ phßng hãa, chiÕt vµ bay h¬i dÞch chiÕt ®Õn c¾n gièng nh­ ph­¬ng ph¸p 2. Hoµ tan c¾n thu ®­îc vµ chuyÓn hçn hîp sang b×nh ®Þnh møc 50 ml víi isopropanol (TT).

Dung dÞch chuÈn mÑ:

Hoµ tan chÊt chuÈn Retinyl acetat trong isopropanol (TT1) ®Ó thu ®­îc dung dÞch cã nång ®é chÝnh x¸c kho¶ng 1000 IU vitamin A trong 1 ml. X¸c ®Þnh nång ®é chÝnh x¸c cña dung dÞch chuÈn mÑ b»ng c¸ch pha lo·ng trong isopropanol (TT1) tíi nång ®é 10 - 15 IU trong 1 ml råi ®o ®é hÊp thô ë b­íc sãng 326 nm trong cèc ®o dµy 1 cm, dïng isopropanol (TT1) lµm mÉu tr¾ng.

 

TÝnh nång ®é vitamin A trong dung dÞch chuÈn mÑ (IU/ml) theo c«ng thøc:

                                                            A326  ´ 1900 ´  V2

                                                                                               (IU/ml)

                                                                       100   x   V1

Trong ®ã :

A326  lµ ®é hÊp thô quang cña dung dÞch ë 326 nm.

V1 lµ thÓ tÝch dung dÞch chuÈn mÑ ®em pha lo·ng (ml).

V2 lµ thÓ tÝch dung dÞch lo·ng ®· pha (ml).

Dung dÞch chuÈn:

LÊy chÝnh x¸c 2 ml dung dÞch chuÈn mÑ ®em xö lý hoµn toµn nh­ mÉu thö. X¸c ®Þnh nång ®é chÝnh x¸c cña dung dÞch chuÈn b»ng c¸ch pha lo·ng trong isopropanol (TT1) tíi nång ®é 10 - 15 IU trong 1 ml råi ®o ®é hÊp thô ë b­íc sãng 325 nm trong cèc ®o dµy 1 cm, dïng isopropanol (TT1) lµm mÉu tr¾ng.

TÝnh nång ®é vitamin A trong dung dÞch chuÈn (IU/ml) theo c«ng thøc:

                                                           

                                                                   A325  ´ 1830 ´  V4

                                                                                                (IU/ml)

                                                                       100 ´  V3

Trong ®ã :

A325 lµ ®é hÊp thô cña dung dÞch ë 325 nm.

V3 lµ thÓ tÝch dung dÞch 3 ®em pha lo·ng (ml).

V4 lµ thÓ tÝch dung dÞch lo·ng ®· pha (ml).

C¸ch tiÕn hµnh :

Gièng nh­ ph­¬ng ph¸p 3.

KÕt qu¶ ®­îc chÊp nhËn nÕu ®¸p øng 3 yªu cÇu sau:

Pic Retinol thu ®­îc tõ dung dÞch thö cã thêi gian l­u gièng víi pic thu ®­îc tõ dung dÞch chuÈn.

Khi dïng ph­¬ng ph¸p thªm chuÈn vµo dung dÞch thö th× kh¶ n¨ng t×m l¹i ph¶i lín h¬n 95%.

Nång ®é dung dÞch chuÈn x¸c ®Þnh b»ng ph­¬ng ph¸p ®o quang ph¶i lín h¬n 95% so víi nång ®é tÝnh tõ dung dÞch chuÈn mÑ.

TÝnh kÕt qu¶:

 

Hµm l­îng vitamin A trong mÉu thö (IU/g) ®­îc tÝnh theo c«ng thøc:

                                                A1 ´  C ´ V    

                                       

                                                A2     ´     m

Trong ®ã :

A1 lµ diÖn tÝch pic cña retinol trªn s¾c ®å cña dung dÞch thö.

A2 lµ diÖn tÝch pic cña retinol trªn s¾c ®å cña dung dÞch chuÈn.

C lµ nång ®é dung dÞch chuÈn gèc ®· pha (IU/ml).

m lµ l­îng chÕ phÈm ®em xö lý thµnh dung dÞch thö (g).

V lµ thÓ tÝch dung dÞch chuÈn gèc ®· ®em xö lý (ml).